Трансформации ДНК на чипах
На сегодняшний день для трансформации ДНК на чипах используются полимеразные и лигазные реакции.
Лигазные реакции применяются в двух вариантах.
Для точной детекции мутаций. Поскольку гибридизация на ДНК чипах недостаточно специфична, то ведётся активная разработка альтернативных гибридизационному методов детекции мутаций на ДНК-чипах, что позволяет сочетать преимущества чип технологии, заключающиеся в возможности одновременного проведения большого числа параллельных реакций. Это обуславливает возможность одновременного анализа множества различных субстратов, а, следовательно, и детекции большого количества возможных мутаций. Со специфичностью традиционных методов лигазного анализа. Сущность этих методов состоит в синтезе двух различных олигонуклеотидных проб 3' и 5', концы которых комплементарны мутантной форме исследуемого сайта. При гибридизации с исследуемой последовательностью 3' и 5' концы проб находятся в непосредственном соседстве. При наличии мутации эти концевые нуклеотиды оказываются полностью комплементарны исследуемой поверхности и соединяются друг с другом лигазой. На конце одного из олигонуклеотидов, не участвующем в лигировании находится репортёрная метка, которая сохраняется при дальнейшей обработке чипа, если произошло лигирование и детектируется соответствующими методами. Если последовательность не мутантная, то соответствующие концы олигонуклеотидных проб оказываются не полностью комплементарными исследуемой последовательности. Они не могут быть соединены лигазой высокотребовательной к полной комплементарности лигируемых концов. При реализации этой реакции на чипе один из олигонуклеотидов иммобилизован на чипе в соответствующей ячейке. А другой находится в растворе вместе с исследуемой пробой и его конец, не участвующий в гибридизации является меченым. После проведения гибридизации и лигирования осуществляется обработка чипа в условиях, вызывающих отделение всех нелигированных репортёрных проб, чип отмывается и оставшиеся на поверхности лигированные пробы детектируются вследствие наличия репортёрной метки на их конце.
Метод имеет значимое преимущество перед традиционным жидкофазным процессом, поскольку позволяет производить большое количество реакций одновременно, вследствие избавления от главного недостатка всех жидкофазных процессов - конкуренции за фермент. Кроме того, только чип позволяет проводить независимую детекцию любого числа проб меченных одинаковым образом. В то время как для жидкофазных реакций требуется мечение каждой пробы различной меткой, поскольку детекция всех проб производится в одном объёме.
Существенными недостатками является необходимость синтеза вне чипа одной пробы для каждой мутации, что делает невозможным детекцию более 1 000 мутаций на одном чипе.
