Гибридизация
Гибридизация является самым важным этапом операций на ДНК-чипах. От её эффективности и специфичности в определяющей мере зависит успех исследований. Именно этот этап остаётся самым трудным для контроля и оптимизации. Особенно трудно повысить специфичность гибридизации. Главным образом за счёт недостаточной специфичности гибридизации полностью провалились попытки осуществить самую привлекательную идею, ради которой и были созданы чипы, состоящую в возможности проведения секвенирования практически неограниченно длинных последовательностей посредством анализа паттерна сигналов одного чипа.
Недостаточная специфичность гибридизации не только делает невозможным секвенирование de novo, но и обуславливает низкую эффективность мутационного анализа уже известных последовательностей, вследствие чего мутационный анализ на чипах становится всё менее привлекательным, поскольку существенно уступает по всем показателям традиционному секвенированию. Низкая специфичность гибридизации существенно обесценивает результаты анализа экспресионной картины. Так показано, что интенсивность сигнала от олигонуклеотидов, комплементарных различным участкам одного и того же гена, может отличаться более чем в 11 тысяч раз. Это вызвано гибридизацией с этими олигонуклеотидами родственных последовательностей, находящихся в большом избытке. Причём этот побочный сигнал трудно предсказуем, так как невозможно учесть какие родственные последовательности и в каком количестве могут быть в данном исследуемом субстрате.
Итак, несовершенство этапа гибридизации, главным образом его низкая специфичность, являются на сегодняшний день самыми важными ограничениями дальнейшего развития ДНК-чип технологии.
Принципиальные трудности гибридизации связаны с фундаментальными особенностями взаимодействующих молекул и ДНК-чип технологий.
Низкая эффективность гибридизации и её крайне низкая скорость, требующая многочасовой экспозиции, обусловлена тем, что взаимодействие иммобилизованной пробы и комплементарной ей исследуемой ДНК последовательности осуществляется только на поверхности чипа, в тонком слое, где иммобилизована ДНК. Объём этого слоя по сравнению с остальным объёмом ячейки крайне мал. Поэтому лишь очень небольшая часть молекул ДНК исследуемого субстрата оказывается в ней в каждый момент времени. Доля среди них ДНК последовательности комплементарной, иммобилизованной может быть очень низка. Следовательно, иммобилизованная ДНК в течение длительного времени подвергается атаке не полностью комплементарных ей последовательностей, которые могут находиться в большом избытке.
