Фиксация препаратов в иммуноцитохимии
Обзор литературы провел резидент КазНМУ Гасанов А.
Как и при любом электронно-микроскопическом исследовании, для сохранения структуры ткани препарат необходимо как можно скорее фиксировать. Пептиды НЭС - низкомолекулярные, хорошо растворимые вещества, и при фиксации их нужно иммобилизовать в ткани. Прецилитирующие фиксаторы, например спирт или ацетон, здесь не подходят - они могут экстрагировать пептидные антигены и не обеспечивают сохранность ультраструктуры ткани. Лучше использовать такие фиксаторы, как параформальдегид и глутаральдегид; они сшивают активные пептидные группы, а последующая обработка тетроксидом осмия фиксирует липидные мембраны. Однако фиксация не должна быть продолжительной, чтобы не повредить сайты связывания антигенов и не блокировать иммуноцитохимическое связывание. Для каждого антигена следует опытным путем подобрать наилучший фиксатор.
При работе с животными максимально быстрое и эффективное проникновение фиксатора в исследуемые органы обеспечивает перфузия.
Фиксаторы могут быть гиперосмотическими (как правило, они дают хорошие результаты, но иногда происходит экстракция некоторых антигенов) или изоосмотическими (по-видимому, последние предпочтительнее). Ниже мы детально рассмотрим некоторые из используемых в нашей лаборатории фиксаторов. Какодилатный буфер можно заменить фосфатным. Какодилат токсичен и может повредить нефиксированные клетки, но его используют для длительного хранения фиксированного материала, поскольку опасность зарастания в таком буфере меньше, чем в фосфатном. Можно готовить фиксаторы на фосфатном буфере, а хранить ткани в какодилатном.
а. Глутаральдегид. Готовят 2,5% (в/о) глутаральдегид в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,2. Хранят раствор при 4°С. Глутаральдегид поступает в продажу в виде 25% раствора, иногда сверхчистого, но последнее непринципиально.
б. Тетроксид осмия. В темный флакон с 50 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,0, погружают ампулу, содержащую 0,5 г тетроксида осмия; разбивают ампулу и оставляют флакон в таком виде на ночь для перемешивания его содержимого. Хранят раствор при 4оС. Пары осмия токсичны, поэтому готовить раствор и выполнять все операции следует в вытяжном шкафу.
в. Глутаральдегид-формальдегидные смеси параформальдегид (для быстрого проникновения в ткань и фиксации антигенов) в фосфатном буфере смешивают с глутаральдегидом (для лучшего сохранения ультраструктуры) в разных пропорциях. Например, берут 4% параформальдегид/0,2% глутаральдегид; 3% параформальдегид/2% глутаральдегид (для быстрой фиксации); 2% параформальдегид/1% глутаральдегид.
Свободный от примесей (например, метанола) параформальдегид присутствует в имеющихся в продаже растворах формалина; его можно приготовить, как описано в протоколе.
4% параформальдегид в 0,1 М фосфатном буфере:
1. Взвешивают 8 г параформальдегида и растворяют его в 90 мл дистиллированной воды, размешивая при температуре 60 оС в вытяжном шкафу.
