Ультраструктурный метод выявления ядрышкового организатора.
Связывание ионов висмута с ядрышковыми организаторами
Обзор литературы провел резидент КазНМУ Гасанов А.
Фибриллярные центры можно визуализировать с помощью обычной электронной микроскопии: на фотографиях они выглядят как электронопрозрачные области в ядрышках клеток. Кроме этого, благодаря аргирофильной природе их можно выявить на ультраструктурном уровне, как это описано в протоколе.
Ультраструктурный метод выявления ЯОР на интерфазных хромосомах
Материалы
0,1 М фосфатный буфер, рН 6,8
1,2-1,8% глутаральдегид в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,8
Фиксатор Карнуа: этанол/уксусная кислота/хлороформ
Реактивы для окрашивания
«Ингибисол» (Taab, UK)
Смола TAAB EM (Taab, UK)
Методика
1. Измельчают свежую ткань.
2. Фиксируют ее в 1,2-1,8% глутаральдегиде в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,8, в течение 10 мин. при 4С.
3. Фиксируют в фиксаторе Карнуа в течение 5 мин при 4С.
4. Промывают один раз в 70% этаноле и два раза в чистой воде.
5. Проводят в затемненном месте стандартную AgЯОР-реакцию в течение 10 мин. при 70С.
6. Промывают несколько раз в чистой воде.
7. Дегидратируют с использованием серии спиртов возрастающей концентрации (до 100% этанола) и затем промывают два раза по 30 мин. 100% этанолом.
8. Промывают два раза по 30 мин. в чистом «Ингибисоле».
9. Помешают ткань на ночь в смесь «Ингибисол»: смола ТААВ ЕМ, 50:50.
10. Помещают ткань на 6 ч в смесь «Ингибисол»: смола ТААВ ЕМ, 25:75.
11. Помещают ткань на ночь в чистую смолу ТААВ ЕМ.
12. Заливают ткань смолой и проводят полимеризацию при 70С.
13. Готовят срезы и монтируют их на сетках Cu/Rh.
14. Окрашивают срезы в течение 10 мин. в растворе уранилацетат/ацетон.
