Выделение ДНК с точковыми мутациями. Амплификация ДНК с помощью ПЦР
Обзор литературы провел резидент КазНМУ Гасанов А.
ДНК можно выделять из фиксированных в формалине, залитых в парафин тканей, подготовленных для обычных гистологических исследований. Под действием формальдегида в ДНК образуются шиффовы основания, а между ДНК и белками сшивки. В водных растворах оба этих процесса обратимы, поэтому ДНК можно выделить из фиксированных формалином тканей. Такая ДНК не является в полной мере интактной, но она находится в двухцепочечной форме, ее можно рестрицировать, гибридизовать с мечеными зондами и амплифицировать с помощью ПЦР. Однако лучше все-таки выделять ДНК из свежих или замороженных тканей, поскольку получаемые при этом препараты более пригодны для большинства стандартных молекулярно-генетических методов.
Выделение ДНК из фиксированных формалином и залитых в парафин препаратов тканей
Материалы
10 х SSC: 1,5 М NaCl, 0,15 М цитрат натрия; рН доводят до 7,0 с помощью 1 М НС1
Протеиназа К: 10 мг/мл в стерильной дистиллированной воде
Смесь:
фенол, хлороформ, изоамиловый спирт (25:24:1)
3 М ацетат натрия, рН 5,2
Охлажденный спирт
Буфер ТЭ:
10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА
Методика
1. С помощью микротома получают 5-10 срезов толщиной 20 мкм.
2. Срезы депарафинируют так же, как при изготовлении обычных гистологических препаратов. Для этого их инкубируют по 10 мин в трех сменах ксилола, 100% этанола, 70% этанола и воды, а затем ополаскивают 1 х SSC.
3. С помощью стерильного скальпеля или бритвы вырезают нужный кусочек.
4. Помещают его в 3 мл раствора, полученного смешиванием 2470 мкл 1 х SSC, 500 мкл 10% ДСН и 30 мкл протеиназы К (10 мг/мл), и инкубируют при 37С в течение 5-10 сут. Каждые 2-3 сут добавляют новые аликвоты протеиназы К.
5. Экстрагируют белки смесью: фенол, хлороформ, изоамиловый спирт (25:24:1).
6. Осаждают ДНК охлажденным спиртом и полученный осадок растворяют в 200 мкл ТЭ.
