Методы исследования свертывающей системы крови
Енцов Д.В.
Для определения состояния гемокоагуляции используют несколько групп методов:
•ориентировочные (базисные) методы, характеризующие процесс свертывания в целом, отдельные его фазы, а также дающие возможность оценить внешний и внутренний механизмы коагуляции
•методы, позволяющие дифференцировать дефицит отдельных факторов свертывания крови
•методы, позволяющие выявить внутрисосудистую активацию системы свертывания крови
К базисным методам относятся:
1.определение времени свертывания крови
2.определение времени рекальцификации стабилизированной крови (плазмы)
3.протромбиновое время (протромбиновый индекс)
4.тромбиновое время
1. Время свертывания крови
1.1 Определение времени свертывания цельной нестабилизированной крови проводится непосредственно у постели больного.
Иглой без шприца пунктируют локтевую вену. Первые капли крови выпускают на ватный тампон и набирают по 1 мл крови в 2 сухие пробирки. Включив секундомер, ставят пробирки в водяную баню при температуре 37°С. Через 2-3 мин, а затем каждые 30 с. пробирки слегка наклоняют, определяя момент, когда кровь свернется. Определив время образования сгустка крови в каждой из пробирок, вычисляют средний результат.
В норме время свертывания составляет 5-10 мин.
Удлинение времени свертывания свидетельствует о значительных сдвигах в системе гемокоагуляции и чаще указывает на:
•выраженную недостаточность факторов, участвующих во внутреннем механизме коагуляции
•дефицит протромбина
•дефицит фибриногена
•наличие в крови ингибиторов свертывания, в частности гепарина
1.2 Метод Моравица
В клинике до сих пор используется еще один упрощенный метод определения времени свертывания крови. Он применяется, в основном, для динамического контроля за состоянием гемокоагуляции при лечении прямыми антикоагулянтами.
На предметное стекло наносят каплю крови, взятую из пальца или мочки уха. Включив секундомер, каждые 20-30 секунд в каплю крови опускают тонкий стеклянный капилляр. Время свертывания определяют в момент появления первой тонкой нити фибрина при вытягивании капилляра из капли крови.
В норме свертывание крови составляет около 5 мин.
2. Активированное время рекальцификации плазмы
Метод основан на измерении времени свертывания тромбоцитарной плазмы при добавлении в нее оптимального количества кальция хлорида или каолина, что обеспечивает стандартизацию контактной активизации факторов свертывания.
В пробирку с раствором кальция хлорида или каолина, установленную в водяной бане при температуре 37°С, добавляют 0,1 мл плазмы и по секундомеру определяют время образования сгустка.
В норме время рекальцификации плазмы с кальция хлоридом составляет 60-120 с., с каолином — 50-70 с.
Изменения этого показателя неспецифичны и указывают лишь на общую тенденцию к гиперкоагуляции (укорочение времени рекальцификации) или к гипокоагуляции (увеличение показателя).
Удлинение времени рекальцификации может быть обусловлено:
•Недостаточностью большинства плазменных факторов свертывания (кроме факторов VII и XIII).
•Дефицитом тромбоцитарного фактора III (при выраженной тромбоцитопении или нарушении реакции высвобождения).
•Избыточным содержанием в плазме ингибиторов свертывания (гепарина)
•Наличием ДВС-синдрома.
3. Активированное частичное (парциальное) тромбопластиновое время (АЧТВ)
Принцип метода заключается в определении времени свертывания плазмы в условиях стандартизации не только контактной, но и фосфолипидной (тромбопластиновой) активации факторов свертывания. С этой целью к плазме добавляют смесь каолина и кефалина (тромбопластиновый активатор), а также кальция хлорид и по секундомеру определяют время свертывания плазмы.
В норме АЧТВ (кефалин-каолиновое время) составляет 35-50 с.
Уменьшение АЧТВ свидетельствует о гиперкоагуляции и склонности к тромбозам, увеличение — о гипокоагуляции крови.
АЧТВ чрезвычайно чувствительно к дефициту плазменных факторов свертывания, участвующих во внутреннем механизме свертывания (факторы XII, XI, IX, VIII) и не зависит от дефицита тромбоцитов или их функциональной недостаточности (в связи с добавлением кефалина).
АЧТВ удлиняется также при наличии в крови ингибиторов свертывания (гепарина) и может быть использован как чувствительный тест для контроля за лечением гепарином.
4. Протромбиновое время (ПВ, протромбиновый индекс)
Метод представляет собой еще одну модификацию определения времени рекальцификации плазмы при добавлении в нее тканевого тромбопластина человека или кролика, что приводит к «запуску» свертывания по внешнему механизму. Тканевой тромбопластин в комплексе с фактором VII и ионом Са2+ активирует фактор X, входящий в состав «проактиватора протромбина».
В пробирку с 0,1 мл плазмы и 0,1 мл раствора тромбопластина, установленную в водяной бане при температуре 37°С, добавляют 0,1 мл раствора кальция хлорида и по секундомеру определяют время образования сгустка.
В норме протромбиновое время составляет 12-18 с. и во многом зависит от активности тканевого тромбопластина, использованного при исследовании. Поэтому в большинстве случаев для определения этого показателя одновременно по той же методике исследуют плазму донора и вычисляют так называемый протромбиновый индекс (ПИ):
ПИ=(ПBд/ ПВб )*100%,
где ПИ — протромбиновый индекс, ПBд и ПВб — протромбиновое время донора и больного, соответственно. В норме протромбиновый индекс составляет 90—100%. Чем больше протромбиновое время, свидетельствующее о гипокоагуляции крови, тем меньше значения протромбинового индекса.
Удлинение протромбинового времени (уменьшение протромбинового индекса) интегрально отражает недостаточность плазменных факторов, участвующих во внешнем механизме свертывания и в активации протромбина (VII, X, V), а также на конечных этапах коагуляции (I и II).
Наиболее частыми причинами такого изменения являются:
•Прием непрямых антикоагулянтов (фенилин, синкумор, неодикумарин и др.).
•Дефицит соответствующих витамин К-зависимых факторов свертывания (факторы II, VII, IХ, X) при тяжелых поражениях паренхимы печени (гепатит, цирроз, рак) и недостаточности витамина К (механическая желтуха, нарушения всасывания в кишечнике, дисбактериоз кишечника и т. п.).
•Дефицит фибриногена (гипофибриногенемия), являющегося К-независимым фактором свертывания (тяжелые поражения паренхимы печени и др.).
•Наличие феномена паракоагуляции, в частности, при ДВС-синдроме.
МНО (Международное нормализованное отношение, INR) - показатель системы свертывания крови.
•Основные показания к применению: лечение антикоагулянтами непрямого действия - варфарином, аценокумаролом и другими аналогами.
•МНО - показатель, рассчитывающийся при определении протромбинового времени.
•Определение МНО гарантирует возможность сравнения результатов при определении ПВ, обеспечивая точный контроль терапии непрямыми антикоагулянтами.
•Для диагностики нарушений свертывания крови используют показатель ПВ, выражающийся в секундах.
•В тех случаях, когда определение ПВ применяют для оценки проведения лечения варфарином, используется показатель МНО - международное нормализованное отношение (INR - International Normalized Ratio).
•Этот показатель позволяет выразить результаты ПВ с учетом использования в различных лабораториях коммерческих препаратов тромбопластина, используемого в определении ПВ.
•Такой подход гарантирует возможность сравнения результатов полученных в разных лабораториях и проводить более точный контроль при лечении антикоагулянтами непрямого действия.
•МНО вычисляется при делении ПВ пациента на значение нормального ПВ, далее результат возводится в степень, показатель которой равен международному индексу чувствительности (ISI или МИЧ - международный индекс чувствительности) тромбопластина:
МНО = (ПВ пациента/среднее нормальное ПВ)
•Доза антикоагулянта подбирается так, что бы поддерживать МНО на необходимом уровне, в зависимости от заболевания.
•Наиболее часто используемым антикоагулянтом непрямого действия в клинической практике является варфарин.
•Применять анализ целесообразно с одновременным определением АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время).
Референтные значения МНО:
•В каждом конкретном случае необходимо поддерживать МНО на определенном уровне. Дозы назначаемого препарата выбираются лечащим врачом.
•В норме: МНО = 0,8 - 1,15.
•При лечении венозного тромбоза: МНО = 2,0-3,0.
•Лечение артериальной тромбоэмболии, рецидивирующей системной эмболии: МНО= 3,0 -4,0.
•Профилактика пристеночных тромбозов при мерцательной аритмии: МНО=1,5-2.
Факторы, искажающие результат:
•Недостаточное наполнение пробирки кровью, недостаточное перемешивание крови с антикоагулянтом, а также несвоевременная отправка пробы в лабораторию.
•Гемолиз вследствие травматичной пункции вены или небрежного обращения с пробой крови.
Увеличение показателя МНО:
•Болезни печени.
•Дефицит витамина К.
•Внутрисосудистое свёртывание.
•Наследственный дефицит факторов II (протромбин), V, VII, X.
•Афибриногенемия.
•Гипофибриногенемия (уровень фибриногена менее 50 мг/100 мл).
•Дисфибриногенемия.
•Лечение кумарином.
•Циркулирующие антикоагулянты.
5. Тромбиновое время
Метод оценки тромбинового времени заключается в определении времени свертывания плазмы при добавлении в нее тромбина со стандартной активностью, который обладает способностью индуцировать превращение фибриногена в фибрин без участия других факторов свертывания крови.
В пробирку с 0,2 мл плазмы, установленную в водяной бане при температуре 37°С, добавляют 0,2 мл стандартного раствора тромбина и по секундомеру определяют время образования сгустка. В норме тромбиновое время составляет 15-18 с.
Определение тромбинового времени позволяет оценить конечный этап свертывания крови (превращение фибриногена в фибрин). Тромбиновое время, таким образом, зависит от концентрации фибриногена, его свойств и наличия в крови ингибиторов тромбина (гепарин, антитромбин III).
Причинами удлинения тромбинового времени являются:
•Афибриногенемия и гипофибриногенемия.
•ДВС-синдром и другие патологические состояния, сопровождающиеся феноменом паракоагуляции с нарушением процесса полимеризации фибрина и нарастанием концентрации в крови продуктов деградации фибрина (ПДФ).
•Тяжелые поражения белковосинтетичекой функции печени, сопровождающиеся снижением синтеза фибриногена.
•Острый фибринолиз.
•Увеличение в крови концентрации ингибиторов тромбина (антитромбина III, гепарина).
Определение тромбинового времени используется для контроля за лечением гепарином и фибринолитиками.
6. Аутокоагуляционный тест (АКТ)
Метод заключается в исследовании динамики образования и инактивации тромбина в разведенной в 20 раз и гемолизированной крови пациента при добавлении гипотонического раствора кальция хлорида. Оценивается свертывающая активность гемолизат-кальциевой смеси с помощью гемокоагулографа.
Гемолизированные эритроциты обеспечивают контактную и фосфолипидную активацию процесса свертывания (подобно каолину и кефалину при исследовании активированного частичного тромбопластинового времени). Таким образом, аутокоагуляционный тест оказывается чувствительным к нарушениям внутреннего механизма свертывания.
Показатель
А - Свертывающая активность на 2-й мин инкубации, %
Нормальные величины = 15,5 ± 3,0
Показатель
МА - Максимальная свертывающая активность, %
Нормальные величины = 100 ± 1,1
Показатель
T1 - Время достижения 1/2 максимальной активности, мин
Нормальные величины = 3,7 ± 0,2
Показатель
Т2 - Время достижения максимальной активности, мин
Нормальные величины = 9,5
Показатель
Т - Время от начала инкубации до момен-та, когда активность снижается до 1/2 МА
Нормальные величины = 35
Увеличение значений T1 и Т2, а также уменьшение А и МА свидетельствуют о гипокоагуляции, которая может быть обусловлена:
•дефицитом факторов внутреннего механизма свертывания (XII, XI, IX, VIII)
•дефицитом факторов X и V («проактиватора протромбина»)
•дефицитом факторов конечного этапа коагуляции (I и II)
•избытком ингибиторов тромбина (гепарин, антитромбин III и др.)
7. Тромбоэластография
Широкое распространение в клинической практике получил метод тромбоэластографии, который позволяет регистрировать свертывание крови и изменения упругости сгустка крови во времени (ретракцию и лизис).
Основной частью любого типа тромбоэластографа (гемокоагулографа) является кювета, в которую вносят исследуемую кровь. В кювету погружают стержень с диском или пластиной на конце, которая не касается ее стенок. Стержень связан с регистрирующим устройством тромбоэластографа. Специальное устройство придает кювете колебательно-вращательные движения, которые могут передаваться на стержень (и регистрирующее устройство), только когда в кювете, заполненной кровью, начнется образование нитей фибрина. По мере образования и уплотнения сгустка амплитуда колебаний стержня увеличивается и достигает максимума.
Предложено множество количественных показателей тромбоэластограммы, три из которых заслуживают внимания:
1.Время реакции (R) — время от начала исследования до начала свертывания крови (первых отклонений тромбоэластограммы от прямой линии).
2.Время коагуляции (К) — время от начала движений стержня прибора до момента, когда амплитуда тромбоэластограммы составит 20 мм.
3.Максимальная амплитуда (МА) тромбоэластограммы.
Считается, что время R характеризует в основном первую фазу коагуляции, а время К - интенсивность образования фибрина. Нормальные величины приведенных трех показателей тромбоэластограммы обычно устанавливают эмпирически для каждого прибора. В среднем у здоровых людей время реакции (R) составляет 4-10 мин, время коагуляции (К) — 5-7 мин, а максимальная амплитуда (МА) - 45-65 мин.
Для гиперкоагуляции крови характерно укорочение R, К и увеличение МА, а для гипокоагуляции — удлинение R и К и уменьшение МА.
Следует отметить, что в целом чувствительность тромбоэластографии к нарушениям гемокоагуляции достаточно низкая, сопоставимая с чувствительностью времени свертывания крови, а тромбоэластографические показатели лишь весьма приблизительно отражают отдельные стадии процесса коагуляции. Тем не менее, тромбоэластография может использоваться в клинике для динамического контроля за лечением антикоагулянтами.
Принципы оценки базисных методов диагностики нарушений коагуляционного гемостаза
Оценка свертывания крови с помощью описанных базисных тестов позволяет составить общее ориентировочное представление о процессе коагуляции крови. При этом следует иметь в виду, что такие показатели как время свертывания крови и время рекальцификации плазмы обладают весьма низкой чувствительностью и специфичностью, и, следовательно, информативностью: они изменяются, как правило, лишь при выраженных нарушениях коагуляции крови и не позволяют судить (хотя бы предположительно) о повреждениях отдельных ее механизмов и этапов.
Преимуществом в этом отношении обладают три базисных теста:
1.тромбиновый
2.протромбиновый
3.АЧТВ или АКТ (их изменения сходны)
Они позволяют судить не только о состоянии всей свертывающей системы в целом, но и о возможной недостаточности отдельных факторов свертывания.
•При дефиците фактора VII (проконвертина), участвующего только во внешнем механизме свертывания, удлиняется только протромбиновое время, а тромбиновый тест и АЧТВ остаются без изменения.
•При дефиците факторов XII, XI, IX, VIII и прекалликреина, участвующих только во внутреннем механизме коагуляции, изменяются АЧТВ (и АКТ), а протромбиновое и тромбиновое время свертывания остаются нормальными.
•При дефиците факторов X, V, II, на которых замыкаются оба механизма свертывания, нарушения обнаруживаются как в протромбиновом тесте, так и в АЧТВ. Тромбиновое время при этом не изменяется.
•Наконец, при нарушениях количества, структуры и свойств фибриногена (фактор I) изменения выявляются при выполнении всех трех базисных тестов. При этом целесообразно также оценить уровень фибриногена в сыворотке крови (см. ниже).
•При дефиците фактора XIII показания всех трех базисных тестов оказываются нормальными.
Дальнейшее уточнение механизмов нарушения коагуляции крови производят с помощью дифференцирующих тестов, подробно описанных в специальных руководствах.
8. Определение фибриногена
Наибольшее распространение в клинической практике получили два метода определения фибриногена:
1.Гравиметрический метод заключается в высушивании и взвешивании сгустка, который образуется при добавлении в плазму 0,2 мл стандартного раствора тромбина.
2.Колориметрический метод также основан на превращении фибриногена в фибрин путем добавления в плазму раствора тромбина. Фибриновый сгусток подвергают гидролизу, а в гидролизат добавляют биуретовый реактив (см. выше) и колориметрируют, определяя концентрацию белка.
Оба метода дают близкие результаты. Содержание фибриногена в плазме здорового человека составляет 2-4 г/л.
Уменьшение концентрации фибриногена наблюдается:
•при врожденной недостаточности фибриногена (афибриногенемия, гипофибриногенемия, некоторые варианты дисфибриногенемии)
•при тяжелых заболеваниях паренхимы печени (цирроз, рак, гепатит)
•при ДВС-синдроме
•при остром фибринолизе
Нередко встречается увеличение концентрации фибриногена. Наиболее частыми причинами гиперфибриногенемии являются:
•острые инфекционные заболевания
•острые и хронические воспалительные заболевания
•злокачественные новообразования
•тромбозы и тромбоэмболии, в том числе у больных острым инфарктом миокарда, ишемическим инсультом и т. п.
9. Определение высокомолекулярных производных фибриногена
Наиболее важными в практическом отношении высокомолекулярными производными фибриногена являются:
1) Растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК) - представляет собой высокомолекулярные растворимые комплексы фибрин-мономера с фибриногеном и с продуктами расщепления фибриногена/фибрина. В норме РФМК не обнаруживаются. Появление РФМК в плазме свидетельствует о нарушении процесса нормальной полимеризации фибрин-мономеров. РФМК плохо коагулируют под влиянием тромбина, обладая относительной тромбинрезистентностью
2) Продукты деградации фибриногена (ПДФ) - в небольших количествах образуются и в норме в результате расщепления фибрина, присутствующего в плазме и в отложениях, под влиянием плазмина (см. ниже). Повышение содержания ПДВ - признак усиливающегося внутрисосудистого свертывания крови или массивных тромбоэмболий, сопровождающихся активацией фибринолитической системы.
Определение растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК). Для выявления РФМК в клинике чаще используются так называемые паракоагуляционные тесты. Они основаны на феномене неферментативного свертывания РФМК: при добавлении к плазме, в которой содержатся РФМК, 50% раствора этанола или 1% раствора протамина сульфата из растворимых комплексов фибрин-мономера с продуктами расщепления фибриногена/фибрина и фибриногеном высвобождаются фибрин-мономеры, которые затем полимеризуются с образованием геля. Проба с 50% раствором этанола является более чувствительной. В пробирку набирают 0,15 мл 50% этанола и 0,5 мл плазмы. Пробирку встряхивают и помещают в штатив при комнатной температуре. Проба расценивается как положительная, если через 1-10 мин в пробирке образуется гель. Помутнение или появление небольшой зернистости является признаком отрицательной пробы (нормальный показатель). Проба с протамина сульфатом позволяет выявить не только полимеризацию фибрин-мономеров, высвобождающихся из РФМК, но и обнаружить осаждение ранних продуктов расщепления фибриногена/фибрина.
Перед началом исследования предварительно готовят 5 разведений 1% раствора протамина сульфата (в 5, 10, 20, 40 и 80 раз). В каждое из приготовленных разведений добавляют 0,2 мл плазмы. Пробирки оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Оценка результатов проводится так же, как и в пробе с этанолом. В норме отрицательный результат обнаруживают во всех разведениях протамина сульфата. Если хотя бы в одном из разведений образуется гель, результат оценивается как положительный.
Положительная проба с этанолом, а также положительный результат протаминсульфатной пробы в первых 1-2 разведениях свидетельствует о наличии в плазме РФМК. Образование геля во всех разведениях протамина сульфата больше характерно для повышения уровня ранних продуктов расщепления фибриногена/фибрина.
Положительные результаты обеих проб встречаются при ДВС-синдроме или массивных тромбозах и тромбоэмболиях, сопровождающихся активацией системы фибринолиза.
Определение продуктов деградации фибрина (ПДФ). Для определения ПДФ в крови используют различные иммунологические и неиммунологические методы. Наиболее простым из них является проба с протамина сульфатом. В пробирку набирают 0,4 мл свежей сыворотки крови и добавляют 0,1 мл 1% раствора протамина сульфата. Помутнение или мелкую зернистость оценивают как отрицательный результат (норма), а образование геля, хлопьев или нитей фибрина — как положительный, свидетельствующий о повышении содержания ПДФ в сыворотке крови больше 0,015 г/л.
В основе иммунодиффузного метода определения ПДФ лежит образование дуг преципитации на агаровой пластине, на которую наносят на определенном расстоянии друг от друга исследуемую и антифибриногеновую сыворотки. Обычно используют стандартную антисыворотку, которую помещают в центральные лунки на агаровой пластинке. В периферические лунки вносят исследуемую сыворотку в различных разведениях (в 2, 4, 8, 16 и 32 раза). Результат определяют через сутки инкубации при комнатной температуре. При повышении в сыворотке ПДФ более 0,016-0,020 г/л на агаровой пластинке определяются дуги преципитации. Если известна чувствительность стандартной антифибриногеновой сыворотки, иммунодиффузный метод позволяет количественно определять содержание ПДФ в исследуемой сыворотке.
Повышение концентрации ПДФ в сыворотке крови более 0,015 г/л чаще всего наблюдается:
•при ДВС-синдроме
•при массивных тромбозах и тромбоэмболиях, сопровождающихся активацией фибринолиза
•при лечении фибринолитическими препаратами