Полимеразная цепная реакция. Принципы ПЦР
Резидент КазНМУ им. С.Д. Асфендиярова Гасанов А.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР был предложен в 1983 г. американским исследователем Кари Муллисом. Суть этого метода заключается в специфической амплификации ДНК с помощью полимеразы, осуществляющей избирательный синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров (затравок). Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы с концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. Длина амплифицируемого фрагмента определяется расстоянием между праймерами. Используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность, можно увеличить количество копий изучаемого фрагмента ДНК в сотни миллионов раз. Такое увеличение, позволяющее визуализировать заданный фрагмент ДНК на электрофореграмме, а также использовать продукт амплификации для дальнейшего изучения с помощью других методов, можно считать главным достоинством метода ПЦР. Основной недостаток этого метода - необходимость знания ДНК-последовательностей, фланкирующих изучаемый ген, для создания праймеров.
Для проведения специфической амплификации необходимы:
1) матричная ДНК-мишень (достаточно даже одной молекулы) длиной от 100 до - 35 000 п.н.;
2) два искусственно синтезированных праймера - олигонуклеотидные последовательности длиной 15-30 п.н.;
3) термостабильная ДНК-полимераза (чаще используют ДНК-полимеразу Thermus aquaticus, или Taq), сохраняющая свою активность при температуре 94°С и выше;
4) четыре дезоксирибонуклеотида.
ПЦР состоит из многократных повторений цикла, состоящего из трех этапов:
1) денатурации (плавления) двухцепочечных структур - перевод их водноцепочечную форму путем нагревания до температуры 94°С;
2) ренатурации или гибридизации (отжига) комплементарных участков ДНК с праймерами при температуре 37—68°С;
3) синтеза последовательности, комплементарной матричной ДНК при 72°С.
В первом цикле праймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК и образуют так называемые «длинные матрицы». В последующих циклах праймеры спариваются с вновь синтезированными молекулами ДНК, образуя «короткие матрицы». При этом синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного режима, а по достижении ДН К-полимеразой границы амплифицированного участка. Скорость синтеза определяется длиной амплифицируемого фрагмента. Как правило, ПЦР включает 25—30 циклов, и к последнему циклу в реакционной смеси содержатся практически только «короткие матрицы» (амплифицируемые фрагменты).
ПЦР обычно проводят в автоматическом режиме, используя для этого специальные приборы — термоциклеры или амплификаторы ДНК, позволяющие задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры для каждого этапа цикла.