Отмывание цитопрепаратов. Детекция гибридизовавшегося зонда цитопрепаратов
Обзор литературы провел резидент КазНМУ Гасанов А.
Компоненты, не прореагировавшие при гибридизации, удаляют промыванием в растворе, не дестабилизирующем двухцепочечные гибриды зонд/мишень. Для этого определяют условия, при которых обеспечивается максимальное удаление «неправильных» гибридов. Чтобы уменьшить неспецифическое окрашивание, блокируют участки связывания антитела и авидина и ингибируют эндогенные ферменты. Это очень важно для повышения специфичности и чувствительности неизотопной гибридизации in situ, особенно при работе с цитологическими препаратами. Ингибировать эндогенные ферменты можно на любой стадии до нанесения субстрата. В случае иммуноцитохимической детекции с помощью пероксидазы ингибирование обычно проводят после инкубации препаратов с первыми антителами, чтобы предотвратить разрушение антигенов в блокирующем растворе. При гибридизации in situ такой проблемы не возникает, поскольку молекулы-свидетели достаточно стабильны. Однако, если используется комплекс пероксид/азид натрия, в принципе может происходить химическая модификация зондов и мишеней, поэтому мы проводим блокирование пероксидазы до демаскирования. Это обеспечивает эффективное ингибирование пероксидазы эритроцитов и нейтрофилов в мазках шейки матки. Детально соответствующая процедура описана в протоколе.
Для детекции иммуномеченых зондов применяются те же подходы, что и для иммуноцитохимической локализации антигенов. Один момент, на который очень важно обратить внимание, - это повышение чувствительности при выявлении вирусных последовательностей в мазках шейки матки; для этого прибегают к процедуре наслаивания антител, описанной в протоколе для зондов, меченных дигоксигенином. Показано, что это позволяет обнаружить в клеточном материале всего 10 геномных копий вируса папилломы при длине каждой из копий примерно 8 т.н. Чтобы повысить чувствительность еще больше, проводят повторные инкубации с антителами. В результате удается обнаружить 1-2 геномные копии вируса HPV 16 в культуре клеток линии SiHa. Однако при рутинном анализе мазков этот метод может дать слишком большой фон, и в этом случае лучше использовать процедуру, описанную в ч. А протокола.
Отмывание препаратов после гибридизации и детекция одного зонда