Роль NF-KB, P53 и Р21 в регуляции ФНО-α-опосредованного апоптоза лимфоцитов
Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, О.Б. Жукова, А.К. Биктасова, О.Е. Чечина, Е.В. Сазонова, Т.Т. Радзивил, А.Н. Вайс, Н.Ю. Часовских
Исследовали влияние рекомбинантной формы ФНО-α в условиях in vitro на программированную гибель лимфоцитов, полученных у здоровых доноров. Установлено, что проапоптотический эффект данного цитокина реализуется при участии транскрипционных факторов и ингибиторов клеточного цикла. Инкубация лимфоцитарных клеток с рекомбинантным ФНО-α позволила констатировать повышение уровней NF-kB, p21 и снижение содержания нефосфорилированного р53.
ФНО-α представляет собой плейотропный цитокин, играющий важную роль в регуляции иммунного ответа. Одним из механизмов реализации этой функции ФНО-α является поддержание численности лимфоцитов путем модуляции программы их апоптотической гибели [3]. Регуляция апоптоза на молекулярном уровне осуществляется за счет самых разнообразных факторов, обладающих активирующим или, напротив, ингибирующим влиянием на данный процесс. Существенное значение в системе контроля программированной клеточной гибели имеют белки с про- и антиапоптотической функцией, синтез которых зависит от наличия активных форм транскрипционных факторов, таких как NF-kB и р53, образующихся в ответ на поступающие в клетку стимулы. Кроме того, для запуска программы апоптоза необходима задержка клеточного цикла, определяемая накоплением ингибиторов циклинзависимых киназ, в частности p21WAF1/Cip1 [1].
Данные о роли NF-kB, р53 и p21WAF1/Cip1 в ФНО-α-индуцированной гибели являются весьма противоречивыми. На различных клеточных линиях показано, что развивающийся при действии ФНО-α апоптоз сопровождается преимущественной активацией лишь одного из транскрипционных факторов - NF-kB или р53 [5, 7, 13]. Целью данного исследования являлась оценка участия транскрипционных факторов NF-kB и р53, а также ингибитора циклинзависимых киназ p21WAF1/Cip1 в реализации ФНО-α-опосредованного апоптоза лимфоцитов крови.
Методика исследования
В эксперименте in vitro использовали лимфоциты, полученные от 12 здоровых доноров (5 мужчин и 7 женщин в возрасте 22-30 лет). Выделенные из венозной крови стандартным методом на градиенте плотности Ficoll-Paque («Pharmacia»; ρ= 1.077 г/см3) клетки культивировали в течение 18 ч при 37ºС и 5% СО2 в среде RPMI-1640, содержавшей 10% ЭТС и 0.03 мг/мл L-глутамина. Для изучения механизмов ФНО-α-индуцированного апоптоза в параллельные пробы добавляли рекомбинантный ФНО-α (рФНО-α) человека («Biosource») в диапазоне концентраций 0.015-0.150 нг/мл. С помощью ФИТЦ-меченного аннексина V («Beckman Coulter») и йодида пропидия («Beckman Coulter») оценивали количество апоптотических (аннексинположительных) и некротически измененных клеток, воспринимающих и аннексин V, и йодид пропидия, на проточном цитофлюоримстре «Epics XL» («Beckman Coulter») [10].
